Kategorija

Popularni Postovi

1 Steatoza
Dijeta nakon uklanjanja žučnog mjehura
2 Proizvodi
Simptomi bolesti jetre: kakva je bol?
3 Ciroza
Hepatosis jetre - simptomi i liječenje, uključujući heptozu jetrene jetre
Glavni // Žutica

Kako je dijagnosticiran virusni hepatitis C?


Kada je potrebna laboratorijska dijagnostika virusnog hepatitisa C, liječnik nužno uzima u obzir sljedeće važne čimbenike:

  • prisutnost ili odsutnost markera infekcije virusom hepatitisa C u krvi, kao i drugih vrsta;
  • pokazatelji aktivnosti enzima jetre;
  • rezultati kliničkog ispitivanja pacijenta;
  • epidemiološka povijest.

Dijagnoza hepatitisa C s visokim stupnjem pouzdanosti omogućuje samo cjelovit prikaz svih podataka (valja napomenuti da se također provodi i dijagnoza hepatitisa B). Za potpunu dijagnozu virusa provodi se niz testova na krvi:

  • opći test krvi;
  • biokemijski test krvi;
  • PCR za određivanje virusne RNA (lančana reakcija PCR - polimeraze);
  • koagulogram (definicija koagulacije krvi).

Također se izvodi ultrazvuk trbušne šupljine. Može se propisati biopsija šupljine jetre. Samo ako ima sve rezultate na raspolaganju, liječnik će napraviti točnu dijagnozu. Također će se odrediti razina razvoja virusnog procesa u tijelu, izvršiti procjenu stanja jetre i stupanj njegovog oštećenja. Liječnik će odabrati sigurno i učinkovito liječenje.

Dijagnoza virusnog hepatitisa C

Zadaća liječnika u određivanju predispozicije virusnog hepatitisa C uvelike se pojednostavljuje ako ima informacije o postojećim bolestima i pregledima.

Da biste provjerili funkcioniranje jetre, mora se ispitati. Identificiranje disfunkcije u svom radu pomoći će proučavanju krvi. Pretpostavljajući da je hepatitis C, liječnik propisuje posebne studije za otkrivanje protutijela koja se razvijaju u borbi protiv te ozbiljne bolesti.

U istraživanju krvi, virus hepatitisa C u krvi se potvrđuje izravno ili neizravno, temeljeno na RNA - nasljednoj informaciji virusa (određeno PCR - om) ili kada su otkrivena antitijela u krvi. Ako se pomoću PCR-a potvrdi prisutnost virusa u krvi RNA, to ukazuje na akutni tijek bolesti.

U prisutnosti protutijela protiv virusa hepatitisa C, postoje dvije mogućnosti - bilo kronični tijek bolesti ili je zaraza ranije zabilježena. Činjenica je da čak i nakon potpunog izlječenja, protutijela se dugo nalaze u ljudskoj krvi.

To jest, laboratorij dijagnoza znači, za određivanje da li je promjena analize antitijela na virus hepatitisa C (HCV dijagnostika provesti ako B antitijela na taj tip virusa). Ako je rezultat pozitivan, izrađena je izravna istraga o prisutnosti virusa u krvi. Zbog toga se koristi metoda lančane reakcije PCR-polimeraze. PCR test je osobito osjetljiv, a posebno se koristi za potvrdu prisutnosti u ljudskoj krvi virusa hepatitisa C.

S obzirom na činjenicu da ljudi s kroničnim hepatitisom C, vrlo je velika vjerojatnost pojave raka jetre, sustavno u pravilnim razmacima (šest mjeseci do godine dana) se krvni test za određivanje prisutnosti tumorskih biljega za rak jetre, ili alfa-fetoprotein. Točno u istom vremenskom intervalu provodi se ultrazvučni pregled jetre.

Ako su rezultati ispitivanja pozitivni, tj. Ako je PCR analiza potvrdila prisutnost virusa u tijelu, biopsiju jetre može propisati liječnik. Ovaj postupak omogućuje vam da vidite koliko je virus uobičajen u jetri i odrediti opseg njegove štetnosti.

Kada se obavlja biopsija, preuzima se tkivo jetre. Za analizu, materijal se uzima posebnom iglom. Nadalje, dobiveni uzorak tkiva podvrgnut je studiji koja se izvodi pod mikroskopom.

Za dijagnozu se propisuju i drugi postupci, kao što je CTG, ultrazvuk. Koriste se za isključivanje raka jetre.

Test krvi također se daje za određivanje tipa virusa hepatitisa C ili njegovog genotipa koji je utjecao na tijelo bolesne osobe. Ako postoje podaci o genotipu virusa i području oštećenja jetre, liječniku će biti lakše pronaći potrebne metode liječenja.

Analiza za hepatitis C

Potrebno je provjeriti i uzeti krvne pretrage za hepatitis C, uključujući PCR test, ako:

  • postoje simptomi bilo koje bolesti jetre, na primjer, loš test krvi;
  • Koriste se sterilne šprice, čak i ako se to dogodilo prije mnogo godina;
  • seksualni partner ima bolest poput hepatitisa C;
  • izvršena je hemodijaliza;
  • liječenje je koristilo donorske organe ili krv koje su primljene prije 1992. (nakon ove godine svi su donorski materijali testirani na hepatitis C).

Budite sigurni da prođe test krvi za hepatitis C djelatnika zdravstvenih ustanova, koje su po prirodi svog posla dolaze u dodir sa špricama, krvi i drugim tjelesnim tekućinama patsientov.Nuzhno napomenuti da je trenutno prilika da se testira kod kuće. Za to se koristi posebni test koji se prodaje u ljekarnama. Ako dobijete pozitivan rezultat, odmah idite do liječnika i provjerite, što će utvrditi prisutnost ili odsutnost virusa u tijelu.

Kada dijagnosticira hepatitis C, liječnik će propisati liječenje i dati preporuke kako bi spriječio daljnje širenje virusa.

Liječnik Insider

Medicinsko izdanje mreže

Dijagnoza hepatitisa C

Mnogi ljudi ne znaju da imaju hepatitis C. Test antitijela je jedini način da provjerite ima li osoba hepatitis C. Rezultati mogu biti nejasni, jer pozitivan test ne znači uvijek da osoba ima hepatitis C.

Dijagnoza virusnog hepatitisa C

Za testiranje antitijela na hepatitis C potreban je uzorak krvi. Antitijelo je protein stvoren od strane tijela kako bi se zaštitili od patogena i bolesti. Protutijela otkrivaju tvari koje mogu biti štetne za zdravlje. Medicinski izraz za ove štetne tvari je antigen. Kada protutijelo prepozna antigen, uništava ili zaustavlja daljnje pomicanje u tijelu. Protutijela su specifična za određene patogene ili bolesti, a ostaju u tijelu nakon što je osoba zaražena. To znači da će se antitijela boriti protiv ove bolesti u budućnosti.

Test provjerava prisutnost antitijela na virus hepatitisa C. Ako tijelo ima protutijela, to znači da je jednom osoba bila zaražena virusom. Međutim, to ne znači uvijek da on još uvijek ima tog patogena. Liječnik će uzeti uzorak krvi koja će biti poslana na testiranje. Rezultati mogu potrajati nekoliko dana ili tjedana.

Rezultati analize za hepatitis C

Postoje dva testa za hepatitis C protutijela.

Rezultat je nereaktivan ili negativan - to znači da osoba nema virus. Izuzetak je ako osoba nedavno ugovara virus, na primjer, kontaminiranom krvlju.
Reaktivni ili pozitivni rezultat testa znači da je osoba imala virus, ali to ne znači da ga još uvijek ima. Potrebni su daljnji testovi za provjeru je li virus aktivan.

Liječenje hepatitisa C

Nakon dijagnoze hepatitisa C, osoba mora proći niz različitih testova kako bi vidjela kako virus utječe na tijelo. Ovi testovi će provjeriti oštećenje jetre, odrediti koliko dobro funkcionira jetra i pomoći li liječniku odlučiti o liječenju.
Hepatitis C se tretira antivirusnim lijekovima koji imaju za cilj čišćenje tijela virusa. Drugi cilj lijeka je usporiti štetu jetre. To će smanjiti vjerojatnost da će osoba razviti rak jetre ili ozbiljne ožiljke jetre, poznate kao ciroza. Osoba koja ima hepatitis C treba redovito testirati tijekom liječenja kako bi saznali kako je lijek učinkovit.

Virus hepatitisa C © www. public-domain-image.com

Laboratorijske metode za dijagnozu hepatitisa C

Nakon što je osoba primila reaktivni ili pozitivni rezultat za hepatitis C protutijela, mora proći dva kontrolna testa. Prvi test provjerava ima li osoba virus; druga mjeri količinu virusa u krvi.

PCR dijagnoza hepatitisa C

Prvi kriterij je kvalitativni test za repliciranje Cp gena, također poznat kao PCR dijagnoza. Pozitivan rezultat znači da osoba ima virus hepatitisa C. Negativan rezultat ukazuje na to da je tijelo uništilo virus bez liječenja.
Drugi test je kvantitativni test za RNA replikaciju. Test uspoređuje količinu virusa u tijelu prije, tijekom i nakon tretmana. Što je manja količina virusa u krvi, to je veća vjerojatnost da osoba može eliminirati virus iz njegovog tijela.
Nakon dijagnoze hepatitisa C može se zatražiti i druga ispitivanja:
Ispitivanje hepatitisa A i B. Ako osoba nije prethodno bila izložena ovim oblicima virusa, mora se cijepiti.

Testiranje za otkrivanje soja hepatitisa C. Postoje tri zajednička soja, a svaki tretman je nešto drugačiji.

Testiranje za funkciju jetre, koja provjerava upalu ili oštećenje jetre.

Čimbenici rizika za hepatitis C infekcije

  • HIV;
  • igle za ubrizgavanje lijekova;
  • prisutnost seksualnog partnera s kroničnim hepatitisom C;
  • transplantacija organa ili davanje krvi do 1992.;
  • rad u javnom zdravstvu;
  • Hemodializa je proces koji filtrira krv.

Ljudi rođeni između 1945. i 1965. godine imaju pet puta veću vjerojatnost da će patiti od virusa. Nije jasno zašto imaju višu razinu hepatitisa C nego ostatak populacije. Istraživači vjeruju da bi to moglo biti zbog standarda medicinske prakse u prošlosti, prije uvođenja kontrole infekcije.

Virus hepatitisa C može uzrokovati značajnu štetu tijelu. Što je ranije otkriven virus, to je veća vjerojatnost njegovog liječenja. Trebaju se testirati osobe koje su izložene faktorima rizika ili su u visokorizičnoj skupini.

Laboratorijska dijagnostika virusnog hepatitisa C, B, A

Virusni hepatitis je infektivna upalna bolest jetre, najčešća patologija među ostalim jetrenim lezijama. Ovisno o vrsti virusnog hepatitisa, dijagnoza bolesti se temelji na kliničkim simptomima i laboratorijskim testovima. Pažljivo istražena povijest bolesti i epidemiološka povijest igraju važnu ulogu. Postoji nekoliko oblika virusnog hepatitisa, uzimajući u obzir različite patogene, kliničke manifestacije, tijek i ozbiljnost bolesti. Laboratorijska dijagnoza virusnog hepatitisa u mnogim je slučajevima jedina metoda koja vam omogućuje da točno utvrdite bolest. Trenutno je identificirano i proučeno nekoliko vrsta virusa s hepatotropnim djelovanjem (A, B, C, D, E) koje uzrokuju sličnu kliničku sliku. Zbog slabe i teške dijagnoze hepatitisa C smatra se da je najteža od svih poznatih vrsta.

Virusni hepatitis A

Ima fekalno-oralni put prijenosa, što ga čini široj infekciji. Dijagnoza hepatitisa A nije jako teško. Razdoblje inkubacije je relativno kratko - od 7 do 50 dana; karakterizira oštar početak: postoji visoka temperatura, izraziti astenički sindrom, bol u svim zglobovima - klinički sliči gripi. Trajanje bolesti - 1 mjesec. Blaga tijek bolesti ponekad ne zahtijeva posebne terapijske mjere, postoje slučajevi samoizlječenja.

Virusni hepatitis B

Za subkliničke laboratorijskoj dijagnostici hepatitisa B je jedina metoda točan potvrditi dijagnozu - definirano antigen u krvi i antitijela za protein od patogena, kao i HBV DNA. Putevi prijenosa:

  • parenteralno - kroz krv;
  • seksualno - kroz spermu;
  • vertikalna: od majke do fetusa (kroz majčino mlijeko virus se ne prenosi djetetu).

Infekcija se proguta kada se koristi prljave igle (jedna igla ovisnici koriste) putem alata (u slučaju kirurških intervencija, tetoviranje, akupunktura, piercing uho, manikura, pedikura), u transfuzije krvi. Latentno razdoblje traje od 2 mjeseca do 6 mjeseci. Simptomi koji podsjećaju na početku virusnog hepatitisa A: simptome slične gripi, bol se pojavljuju u cijelom tijelu i zglobovima, teške slabost, malaksalost. Ponekad su osip. Prognoza za akutni hepatitis je relativno povoljna: u 80% slučajeva dolazi do oporavka. Subclinical oblik bolesti često postaje kronična - kako bi se postigla potpuni oporavak u takvim slučajevima rijetko uspije.

Istovremeno, u mnogim slučajevima bolesti, identificira hepatitis B satelit, virus D (delta), koji uzrokuje virusni hepatitis D i otežava tijek bolesti.

Virusni hepatitis E na kliničke simptome sliči HAV-u, ali ima postupan početak i mnogo je opasniji za trudnice.

Manifestacije HCV

Laboratorijska dijagnoza hepatitisa C (HCV) u laboratoriju je osobito važna jer utječe na oko 3% svjetske populacije. Svake se godine povećava učestalost - to je povezano sa stalnim porastom ovisnosti o drogama u svijetu.

Pažnja molim te! Virusni hepatitis C jedan je od najopasnijih i najtežih među poznatim oblicima infektivnog oštećenja jetre. Poznat je kao "nježni ubojica" zbog dugotrajnog subkliničkog protoka, a zatim u brzom ishodu ciroze s mogućim kobnim ishodom. Kombinacija HCV-a s drugim oblicima infektivnog hepatitisa značajno povećava tijek bolesti i ubrzava kobni ishod.

Akutni HCV je asimptomatski pa se rijetko dijagnosticira. Ako je moguće identificirati bolest u ovoj fazi, a pravovremenim početkom liječenja u 20%, može doći do oporavka.

HCV se najčešće promatra u kroničnom obliku, u kasnim fazama. Kronizacija procesa događa se u 50% slučajeva.

Uz asimptomatski prijenos virusa C, jetrene stanice postupno oštećuju, razvija se fibroza. U budućnosti, ako ne postoji pravodobno liječenje, povećava se rizik od ciroze ili raka jetre.

Dijagnoza virusnog hepatitisa u bilo kojem obliku temelji se na definiciji:

  • patogen i njegova replikacija;
  • markeri infekcije.

Dijagnostičke metode uključuju imunokemijske i molekularno-biološke reakcije koje otkrivaju:

  • antigeni patogena;
  • antitijela na virus;
  • nukleinske kiseline.

Struktura C virusa

Virus C (BC) ima jednolančanu RNA u svom genomu. On je jedini među uzročnicima virusnog hepatitisa koji ima takvu strukturu. I nosilac i pacijent ne mogu pogoditi virus koji imaju. Stoga, za otkrivanje patologije s nejasnom dijagnozom, potrebno je provesti niz studija i dijagnostičkih testova.

Genom virusa C (njegova RNA) sastoji se od 10.000 nukleotidnih baza. Takva visoka heterogenost određuje karakteristike HCV-a. Kad su proučavali nukleotide RNA, otkrivene su značajne razlike u njihovoj strukturi. Uzimajući u obzir otkrivene strukturne značajke, stvorena je klasifikacija HCV, prema kojoj:

  • mogućnosti (postoji 6 - 9 od njih);
  • podtipovi;
  • genotipova.

Neki od njih nalaze se u svim zemljama bez iznimke, neki - lokalno u određenim regijama. Nakon penetracije u tijelo virus C se umetne u lanac nukleotida molekule RNA. Neprekidno mu mutira (mutira), a osoba može postati nositelj 50 podtipova istog genotipa virusa. Imunološki sustav ne prati brzu mutaciju: antitijela se proizvode za jednu skupinu virusa, bolest postaje kronična.

Definicija C virusa

Dijagnoza HCV-a postala je stvarnost s pojavom molekularne biologije. To se objašnjava ekstremno niskim sadržajem virusa u krvi, koji ne dopušta izoliranje antigena ranijim metodama.

Kad se sumnja na HCV, laboratorijska dijagnoza ima za cilj odrediti:

  • antitijela (IgG, IgM) pomoću ELISA (enzimski imunotest);
  • RNA virus korištenjem PCR (lančana reakcija polimeraze).

Pažnja molim te! Serološki markeri hepatitisa C su RNA-HCV i protutijela koja nastaju u tijelu.

PCR - definicija virusa hepatitisa C

RNK - HCV pripada ranih markera HCV: njegova pojava u krvi javlja se za 10 - 12 dana nakon infekcije, odnosno znatno ranije povećanje aminotransferaza (AST, ALT, GGT)... Detekcija RNA - HCV označava aktivnu replikaciju (reprodukcijski) virusa. To je „zlatni standard” za dijagnostiku, jer razjašnjava i potvrđuje dijagnozu iu periodu kada simptomi su gotovo odsutan. PCR bi trebao biti izveden za praćenje rezultata ELISA. Obavlja se u kvalitativnim i kvantitativnim varijantama.

Virusna opterećenja smatraju se visokom za PCR> 800 tisuća IU / ml ili 2 milijuna kopija / ml; niska - s PCR-om

Pažnja molim te! PCR nije samo kvalitativna analiza (detekcija RNA virusa), već određuje i broj kopija RNA u 1 ml krvi. Ovo igra važnu ulogu u imenovanju učinkovitog liječenja i procjene uspjeha u terapiji. Ako se RNA virusa C detektira u krvnoj plazmi, to ukazuje na akutnu fazu bolesti. Opseg oštećenja jetre i širenje patoloških promjena - fibroza i upala - otkrivena je nakon biopsije. Ova metoda je najsigurnija i pouzdanija u dijagnozi. Manipulacija je potpuno bezopasna za pacijenta i traje nekoliko sekundi.

ELISA - otkrivanje antitijela na virus

Ljudski imunološki sustav proizvodi protutijela (IgG, IgM) protiv patogena kad uđe bilo koji zarazni agens. Formirani imunoglobulini stvaraju snažan kompleks s inozemnim proteinom (s antigenom virusa), čiji kvantitativni i kvalitativni parametri određuju se tijekom ELISA. Odnosi se na neizravnu metodu ispitivanja: tijekom istrage virusi se ne otkrivaju, ali imunološki odgovor organizma na zarazni agens koji je ušao pojavio. ELISA se izvodi za ranu dijagnozu, praćenje procesa u dinamici.

Protutijela su otkrivena u 80% zaraženih samo 5 do 6 tjedana nakon pojave bolesti, u 90% - 12 tjedana. Ponekad ti testovi daju lažne pozitivne odgovore. Za takve slučajeve postoje posebni testovi - spektar protutijela proteina određen je metodom rekombinantnog imunoblotiranja.

Da bi se postigli pouzdani rezultati, PCR i ELISA testovi se izvode dvaput u određenom vremenskom razdoblju. Tipično, razdoblje je 6 mjeseci.

Taktike promatranja

Kako bi se razjasnila aktivnost procesa u jetri, kako bi se utvrdila taktika liječenja, utvrđeni su testovi na jetri:

  • transaminaze u krvi (ALT, AST, GGT);
  • ukupni bilirubin i njegove frakcije;
  • alkalna fosfataza (AFP);
  • ukupni protein s frakcijama.

Ovisno o rezultatima laboratorijskih istraživanja koriste se različite taktike upravljanja pacijentima:

  • S normalnim brojkama pacijent je pod nadzorom liječnika. Uz promjene u zdravstvu, testovi se ponavljaju.
  • Uz povećanje od 2 ili više puta, ELISA se provodi na anti-HCV.
  • Ako je enzimski imunoanalizam pozitivan, koristi se lančana reakcija PCR-polimeraze koja rezultira odabirom antivirusne terapije.
  • Pri povišenom 2 puta ili više indikatora uzoraka jetre, ali negativno ELISA ili povećanjem jetrene uzoraka 2-struki, i pozitivne IFA PCR dinamičnog praćenje nastavlja inspekciju i kontrolu krvnih biokemijskih testova 1 svaka 3 mjeseca.
  • Kod visokih biokemijskih parametara, pozitivni rezultati ELISA i PCR provode se kliničkom dijagnozom, odabire se antivirusni lijek i kontrolira se liječenje.

Istraživanje biokemijskih pokazatelja

Na temelju rezultata biokemijskog testa krvi procjenjuje se razina aminotransferaza.

  • ALT - alanin aminotransferaza - dio je hepatocita. Čak i lagani višak norme ukazuje na postojeći hepatitis (uključujući virusni) u ranim fazama.
  • AST - aspartat aminotransferaza: ako njegova razina premašuje ALT, to je pokazatelj početne fibroze (proliferacija vezivnog tkiva).

Visoke stope ALT, AST u krvi je rezultat nekroze stanica jetre. Oni su indirektni pokazatelj aktivnosti upalnog procesa. Ako razina ALT prelazi 3 puta norma, govorimo o minimalnom aktivnošću, 3 - 10 puta -umerennaya upalna aktivnost proces, više od 10 puta - hepatitis s visokom aktivnošću.

Razina AST se mijenja i s drugim patologijama, ALT se smatra specifičnijim za bolesti jetre.

  • Povećanje razine ukupnog i izravnog bilirubina javlja se s povećanim obrazovanjem ili odgađanjem izlučivanja iz tijela. Virusni hepatitis javlja se s kršenjem izlučivanja bilirubina. Staklenični i scleri promatrani su na razinama bilirubina iznad 30-35 mmol / 1, uz daljnje nakupljanje žute kože. U kroničnom tijeku to se ne događa.
  • Povećanje alkalne fosfataze (AFP), gama-glutamintransferaze (GGT), kolesterola i žučnih kiselina karakteristično je za sindrom. Ali bolest jetre nije jedini razlog njihovog povećanja.
  • Porast albumina povezan je s oštećenom funkcijom jetre.

Klinička dijagnoza

U korist virusnog hepatitisa C ukazuje se klinička manifestacija. Kronična naravno naznačen oskudne simptoma: poremećena slabost i povećava umor krajem dana, smanjena tolerancija na redovito fizičke aktivnosti. Pod normalnim biokemijskim analizama takve kliničke manifestacije rijetko su povezane s virusnim hepatitisom. Nesavijeno klinička slika se pojavljuje u kasnijim fazama: tamo teleangiektazija i jetre „Stars”, jetre - i splenomegalija, žutica bjeloočnice, kožu i sluznicu usta, svrbež kože (s vrlo visokom razinom bilirubina u krvi), tamna mokraća, neobojene izmet, krvarenje, gubitak težine, palmine jetre.

Pažnja molim te! Ako postoji kronični oblik HCV, karcinom jetre može se razviti s velikom vjerojatnošću, pa je potrebno redovito pregledavati krv onomarkera i alfa-fetoproteina (jednom svakih šest mjeseci).

Ultrazvučni pregled

Osim laboratorijskih metoda, postoje dodatne metode anketiranja koje igraju važnu ulogu u dijagnozi HCV-a. To uključuje ultrazvučne preglede. Ovom metodom ispitivanja proučava se stanje trbušnih organa. Određuje se veličina, gustoća, struktura, položaj organa, opsežne formacije, konkrementacije, kršenje protoka žuči, otkrivanje veličine portala i slezene slezene. Splenomegalija, hepatomegalija, proširenje portalne vene naznačuje hepatitis pri prijelazu na cirozu. Daljnje ispitivanje, serodiagnoza je neophodna za isključenje ili potvrđivanje virusnog hepatitisa C.

Fibroscanning i ostali testovi

Metoda neizravne dijagnoze, ekvivalent biopsije - fibroskaninga (elastometrija): neinvazivna, sigurna, može se ponoviti za kontrolu terapije. Pokazatelji za provedbu elastometrije sumnjaju se na patološke procese u jetri, uključujući - prisutnost virusa.

Postoje i mnogi dijagnostički testovi koji su alternativa biopsiji jetre. Testovi omogućuju određivanje točne morfološke slike oštećenog organa, postojećih fibroza, steatosisa, nekroze ili upale. Neki od njih:

  • FibroTest - sa svojom pomoći, sveobuhvatnu analizu 5 biokemijskih pokazatelja i pravodobnu dijagnozu stanja fibroze.
  • ActiTest - određuje 6 biokemijskih pokazatelja i omogućuje dijagnosticiranje upalnog procesa nekroze u jetri.

Pažnja molim te! Prognoza HCV ovisi o pravovremenoj dijagnozi, o stupnju infekcije i o pacijentovoj želji za izliječenjem. Suvremene terapijske metode uz uporabu antivirusnih lijekova omogućuju liječenje bolesti ili postizanje dugoročne remisije, produljenje života i poboljšanje njegove kvalitete kod zaražene osobe ili nosača. Virusni hepatitis C, unatoč teškoj dijagnozi i produženom liječenju, nije presuda. Potrebno se obratiti liječniku na vrijeme kako biste dobili kvalitetnu medicinsku njegu i pažljivo ispunili sve njegove svrhe.

Virusni hepatitis C

Hepatitis C - virusne infektivne bolesti jetre prenosi transfuzijom, naznačen time, da je često svjetlo subkliničkog, rijetko umjeren naravno u fazi primarne infekcije i sklonost kronične, ciroze i malignosti. U većini slučajeva, hepatitis C ima icteric, low-symptomic napad. S tim u vezi mogu ostati ne dijagnosticira već nekoliko godina i otkrije kad je već razvije cirozu ili maligno događa u hepatocelularnog karcinoma u jetri. Dijagnoza hepatitisa C se smatra dovoljno potkrijepljen u otkrivanju virusnu RNK u krvi i antitijela na nju kao posljedica ponovljenih istraživanja metodom PCR i razne vrste seroloških reakcija.

Virusni hepatitis C

Hepatitis C - virusne infektivne bolesti jetre prenosi transfuzijom, naznačen time, da je često svjetlo subkliničkog, rijetko umjeren naravno u fazi primarne infekcije i sklonost kronične, ciroze i malignosti. Virusni hepatitis C uzrokuje virus koji sadrži RNA obitelji Flaviviridae. Tendencija ove infekcije do kronizacije određena je sposobnošću patogena da ostane u tijelu dugo vremena bez da uzrokuje intenzivne manifestacije infekcije. Kao i ostatak flavivirusa, virus hepatitisa C je u mogućnosti da se množe i formiraju kvazishtammy imaju različite serološke varijante koje sprečava tijelo od formiranja adekvatan imunološki odgovor i omogućuje razvoj učinkovitog cjepiva.

Virus hepatitisa C ne replicira u staničnim kulturama koje ne dopuštaju detaljnu studiju o njegovoj stabilnosti u okruženju, ali se zna da je malo stabilniji od HIV-a, koji je poginuo kada je izložena UV zrakama i podnosi zagrijavanje do 50 ° C. Rezervoar i izvor zaraze su bolesni ljudi. Virus se nalazi u krvnoj plazmi bolesnika. Infektivni kao oni koji pate od akutnog ili kroničnog hepatitisa C i ljudi s asimptomatskom infekcijom.

Mehanizam prijenosa virusa hepatitisa C - parenteralno, poželjno prenosi putem krvi, ali ponekad može nastati kontaminacija kontakta s tjelesnim tekućinama: sline, urina, sjemena. Preduvjet za zarazu je izravni unos dovoljne količine virusa u krv zdrave osobe.

U velikoj većini slučajeva, u ovom trenutku, infekcija se javlja uz zajedničku uporabu lijekova intravenozno. Širenje infekcije među ovisnicima doseže 70-90%. Osobe koje koriste lijekove su najopasniji u pogledu izvora epidemije virusnim hepatitisom C. K tome, rizik od infekcije je povećana kod pacijenata koji su primili medicinske skrbi u obliku višestrukih transfuzija krvi, kirurške intervencije, parenteralnu primjenu i uboda pomoću ne-sterilno za višekratnu upotrebu. Prijenos se može provesti primjenom tetovaža, piercinga, rezova tijekom manikure i pedikura, manipulacija u stomatologiji.

U 40-50% slučajeva nije moguće pratiti način infekcije. U medicinskim profesionalnim skupinama incidencija hepatitisa C ne prelazi populaciju. Prijelaz od majke do djeteta provodi se kada se visoki koncentracija virusa akumulira u krvi majke, ili kada se hepatitis C virus kombinira s virusom humane imunodeficijencije.

Mala je mogućnost razvoja hepatitisa C s jednim udarcem malog broja patogena u krvotoku zdrave osobe. Seksualno prenošenje infekcije je rijetko, prvenstveno kod osoba s istodobnom HIV infekcijom, sklonih čestim promjenama u seksualnim partnerima. Prirodna osjetljivost osobe na virus hepatitisa C u velikoj mjeri ovisi o primljenoj dozi patogena. Postinfekcijski imunitet nije dobro poznat.

Simptomi virusnog hepatitisa C

Razdoblje inkubacije virusa hepatitisa C u rasponu od 2 do 23 tjedana, 26 tjedana ponekad prije povlačenja dima (uzrokovano činjenicom da se prijenos ili na drugi način). Akutna faza infekcije u velikoj većini slučajeva (95%) ne očituje se s ozbiljnim simptomima, curenja u subklinijskoj inačici žutice. Kasnije Serološka dijagnoza hepatitisa C može biti povezan s vjerojatnošću od „imunološkog prozora” - vrijeme kada se, unatoč postojećim infekcije, antitijela na patogena nedostaje ili titar neizmjerno mali. U 61% slučajeva, virusni hepatitis je dijagnosticiran laboratorij nakon 6 mjeseci ili više nakon prvih kliničkih simptoma.

Klinički, manifestacija virusnog hepatitisa C može se manifestirati u obliku općih simptoma: slabosti, apatije, smanjenog apetita, brzog zasićenja. Možda postoje lokalni znakovi: težina i nemir u pravoj hipohondriji, probavne smetnje. Vrućica i opijenost virusnog hepatitisa C prilično su rijetki simptomi. Tjelesna temperatura, ako se diže, a zatim do subfebrilnih vrijednosti. Intenzitet manifestacije ovih ili drugih simptoma često ovisi o koncentraciji virusa u krvi, općem stanju imuniteta. Obično, simptomatologija je beznačajna i pacijenti nisu skloni pridavati važnost za to.

U analizi krvi u akutnom razdoblju hepatitisa C, često se naziva nizak sadržaj leukocita i trombocita. U četvrtini slučajeva zabilježena je kratkotrajna blaga enklava (često ograničena na sklerozu i biokemijske manifestacije). Kasnije, s kroničnom infekcijom, epizoda žutica i povećana aktivnost hepatičnih transferaza prate egzacerbacije bolesti.

Ozbiljni tijek virusnog hepatitisa C opažen je u ne više od 1% slučajeva. U tom slučaju mogu nastati autoimuni poremećaji: agranulocitoza, aplastična anemija, periferni živčani neuritis. S takvim trenutnim, smrtonosni ishod je moguć u razdoblju prije infantile. U normalnim slučajevima, virusni hepatitis C polako napreduje, bez značajnih simptoma, već godinama ostaje nedijagnosticiran i manifestira se čak i uz značajno uništavanje tkiva jetre. Prvi put kod bolesnika se dijagnosticira hepatitis C, kada postoje znakovi ciroze ili hepatocelularnog karcinoma jetre.

Komplikacije virusnog hepatitisa C su ciroza i primarni karcinom jetre (hepatocelularni karcinom).

Dijagnoza virusnog hepatitisa C

Za razliku od hepatitisa B, koji se može osloboditi, virusnog antigena kliničku dijagnozu hepatitis C virusa proizvedene serološkim metodama (IgM antitijela na virus su određene pomoću ELISA i RIBA) i određivanje virusa RNA u krvi pomoću PCR. U ovom slučaju, PCR se provodi dva puta, jer postoji vjerojatnost lažne pozitivne reakcije.

Kada se detektiraju antitijela i RNA, može se reći o dovoljnoj pouzdanosti dijagnoze. Određivanje u krvi IgG može značiti i prisutnost virusa u tijelu, i prethodno prenesena infekcija. Pacijenti s hepatitisom C dodjeljuju se za provođenje biokemijskih testova jetre, koagulograma, ultrazvuka jetre, te u nekim složenim dijagnostičkim slučajevima - biopsijom jetre.

Liječenje virusnog hepatitisa C

Strategije liječenja za hepatitis je isti kao u virusni hepatitis B: dijetalna pir №5 (granične masti, naročito vatrostalni, na normalnom omjeru proteina i ugljikohidrata), s izuzetkom proizvoda koji stimuliraju izlučivanje žuči i jetrenih enzima (slane, pečeno, sačuvana hrane ), zasićenost prehrane s lipolitičkim aktivnim tvarima (vlakna, pektini), veliku količinu tekućine. Alkohol je potpuno isključen.

Specifična terapija virusnog hepatitisa je imenovanje interferona u kombinaciji s ribavirinom. Trajanje terapeutskog tečaja je 25 dana (ako je varijanta virusa otporna na antivirusnu terapiju, tečaj se može produžiti do 48 dana). Kao prevenciju kolestaza terapijske mjere su složene pripravke ursodeoksiholievoy kiseline i kao antidepresiv (kao psihološkog stanja bolesnika često utječe na učinkovitost liječenja) - ademetionine. Učinak antivirusne terapije izravno ovisi o kvaliteti interferona (stupnju pročišćavanja), intenzitetu terapije i općem stanju pacijenta.

Prema indikacijama, osnovna terapija može biti dopunjena oralnom detoksikacijom, antispazmodicima, enzimima (mezim), antihistaminicima i vitaminima. U teškom hepatitisu C, intravenska detoksikacija s otopinama elektrolita, glukoza, dekstran je naznačena, ako je potrebno, terapija se nadopunjuje prednizolonom. U slučaju komplikacija, tijek liječenja nadopunjuje odgovarajućim mjerama (liječenje ciroze i raka jetre). Ako je potrebno, proizvodite plazmoferezu.

Prognoza za virusni hepatitis C

S pravilnim liječenjem, 15-25% slučajeva je završeno. Najčešće se hepatitis C pretvara u kronični oblik, pridonoseći razvoju komplikacija. Smrt s hepatitisom C obično se javlja zbog ciroze ili raka jetre, smrtnost je 1-5% slučajeva. Prognoza ko-infekcije virusima hepatitisa B i C manje je povoljna.

Sprječavanje virusnog hepatitisa C

Zajednički hepatitisa C preventivne mjere uključuju pažljivu poštivanje sanitarnih režima u medicinskim ustanovama, kontrola kvalitete i sterilnosti krvi transfuzije, a sanitarni nadzor nad ustanovama koje pružaju usluge za osobe s traumatskim postupaka (tetoviranje, piercing).

Između ostalog, provode se aktivnosti za podizanje svijesti i edukacije među mladima, oglašava se individualna prevencija: siguran seks i napuštanje droga, medicinski i drugi traumatski postupci u ovlaštenim ustanovama. Od ovisnika o drogama distribuiraju se jednokratne šprice.

Laboratorijska dijagnoza hepatitisa C

MI Mikhailov, Institut za epidemiologiju i mikrobiologiju. NF Gamalei RAMS, Moskva

Prilikom utvrđivanja dijagnoze "hepatitisa C" potrebno je razmotriti sljedeće najvažnije čimbenike:

  • pokazatelji aktivnosti enzima "jetrene";
  • prisutnost ili odsutnost markera infekcije virusom hepatitisa C (HCV) i drugih hepatotropnih virusa;
  • epidemiološka povijest;
  • rezultati kliničkog ispitivanja pacijenta. Samo sveobuhvatan prikaz ovih čimbenika omogućava dijagnozu ove bolesti s visokim stupnjem pouzdanosti. Laboratorijski radnik treba pružiti objektivne informacije o otkrivenom spektru virusnih antigena i protutijela, kao i HCV RNA, što omogućuje kliničaru, službeniku za transfuziju krvi i epidemiologu da riješi probleme s kojima se suočavaju. Najčešće je:
  • Identificiranje osoba s HCV-om za smanjenje posttransfuzijskog hepatitisa C;
  • dijagnoza i diferencijacija akutnog i kroničnog hepatitisa C;
  • prognozu bolesti;
  • imenovanje, procjenu i prognozu učinkovitosti terapije;
  • proučiti širinu HCV-a u populaciji i različitim skupinama stanovništva.
    Istodobno, glavna područja rada koje obavlja laboratorijsko osoblje su:
  • razvoj i odabir najpopularnijih metoda za otkrivanje markera HCV infekcije;
  • definiranje kriterija za objektivnu procjenu dobivenih rezultata;
  • razvoj optimalnih algoritama za provođenje laboratorijskih studija;
  • uvođenje sustava za poboljšanje otkrivanja biljega HCV infekcije.

    Osnova laboratorijske dijagnoze hepatitisa C. HCV služi znanja o svojoj replikacije, informacije o dinamici pojave i nestanak markera infekcije, kao i suvremene imunokemijskih i molekularno biološkim metodama za otkrivanje antigena, protutijela i nukleinskih kiselina.

    VIRUS HEPATITIS C. HCV je prvi put identificiran 1988. godine kada je skupina istraživača na čelu s M. Houghtonom i Choo Q.L, koristeći nove molekularne biološke metode istraživanja, klonirala i sekvencirala virusni genom [1]. Čestica virusa hepatitisa C ima sferični oblik s prosječnim promjerom od oko 50 nm [2,3]. Pokušaji vizualizacije i proučavanja strukture virusa hepatitisa C su napravljeni od otkrića virusa, ali još uvijek nema dobro dokumentiranih rezultata tih studija, što može biti posljedica poteškoća akumuliranja virusnih čestica u potrebnim količinama.

    Član VGSedinstvenny roda Hepacivirus iz porodice Flaviviridae, koja uključuje viruse kao što je virus bikove proljeva i svinjske groznice (rod Pestivirus) i žute groznice virus, Dang virus i GB virusa: GBV-A GBV-B i GBV-C / HGV (roda Flavivi-rus). Struktura virusa hepatitisa C može se prikazati kako slijedi (shema br. 1). Nukleokapsid sadrži RNA virusa hepatitisa C nucleocapsid vrh prevučena s udubljenjem u njemu lipidnog omotača premaza proteina kodiranih HCV RNA. Virus genom sadrži linearni RNK molekule jednolančane pozitivne polarnosti, dužine od oko 9600 nukleotida. Organizacija HCV genoma slična je ostalim flavivirusima. Ona razlikuje dvije zone koje kodiraju strukturne i ne-strukturne (funkcionalne) proteine. Geni koji kodiraju strukturne bjelančevine nalaze se u 5 'regiji genoma virusa, a ne-strukturni u 3' regiji. Gena HCV ima jedan otvoren okvir čitanja (ORF), jedan polipeptid (približno 3000 amino kiselina), koji pod djelovanjem stanične i virusne proteaze izrezati u strukturnim i ne-strukturnih proteina.

    Sl. 1. Strukturni elementi HCV

    Strukturne bjelančevine obuhvaćaju proteine ​​kodirane jezgrom, El i E2 s HCV RNA zonama. Identificirani su tri oblika HCV C-proteina: full-length (p21) s molekularnom masom od 21 kD, skraćenom (p19) i (p16) obliku pronađenim u nukleolima zaraženih hepatocita. Na svojoj površini, C-protein nosi različite visoko očuvane epitope B stanica, čije je postojanje iznimno važno za otkrivanje protutijela na HCV tijekom laboratorijske dijagnoze hepatitisa C.

    RNA područja HCV-E1 i E2 kodiraju proteine ​​molekulske mase 31 i 70 kD. Ovi proteini imaju nekoliko N-glikozilacijskih mjesta; U E1 proteinu, identificirano je do 6 takvih mjesta, au E2-11. Podaci o malom proteinu, p7, pronađeni su u odjeljku E2, koji nije pronađen u strukturi virusa.

    Označavanje regija bliže 3'-kraju HCV RNA - kao zone koje nose informacije o ne-strukturnih proteina virusa - ukazuje na to da ti proteini nisu strukturne komponente virusne čestice. U nestacionarnom području HCV RNA dodjeljuju se mjesta označena kao: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B. Većina proteina kodiranih ne-strukturnih zona HCV RNA potrebna je za replikaciju virusa.

    Usporedna analiza nukleotidnih sekvenci RNA izolata HCV-a dobivenih u različitim regijama svijeta, pa čak i za vrijeme bolesti od istog pacijenta, otkrila je glavnu značajku ovog virusa - visoku heterogenost RNA. Odredbe o značajnoj genetskoj varijabilnosti HCV RNA stvorile su osnovu za teorije koje objašnjavaju: dugotrajni (ponekad životni vijek) prijevoza virusa, česti razvoj kronične bolesti, poteškoće u terapiji i stvaranje učinkovitih pripravaka za cjepivo. Najznačajnije razlike u sekvencijama HCV RNA su koncentrirane u N-terminalnom dijelu E2 regije, što se naziva "hipervarijabilna regija" (HVR) [4].

    Trenutno postoji 6 glavnih genotipova i preko 100 podtipova HCV-a. Genotipovi la, lc, 2a, 2c, 2c i 3a čine više od 90% HCV izolata dobivenih u Americi, Europi, Rusiji, Kini, Japanu i Australiji / Novom Zelandu [5]. Genotipovi 4, 5a i 6 zabilježeni su, međutim, u Srednjoj i Južnoj Africi, u jugoistočnoj Aziji. U Rusiji i zemljama ZND-a zabilježena je učestalost genotipa 16 (ne manje od 68,9%) [6,7]. Vjeruje se da bolesnici zaraženi genotipom 1 (osobito 1c) reagiraju na liječenje u usporedbi s pacijentima zaraženim drugim genotipima virusa.

    Kod bolesnika, HCV cirkulira kao populacija virusnih čestica kod kojih se genomi razlikuju za 1-2% (kvazi-specifičnost) kao rezultat mutacija koje se akumuliraju tijekom infekcije i / ili ulaze u pacijenta tijekom infekcije. Ovi mutirani oblici mogu potaknuti aktivniju replikaciju ili mogu pomoći virusu izbjegavanju imunološkog odgovora tijela i potencijalno utječu na ishod akutne infekcije, razlike u tijeku bolesti i odgovor na terapiju interferonom [8].

    ODREĐIVANJE ANTI-HCV. Nakon otkrivanja HCV virusa i odrediti njegovu ulogu u razvoju post transfuzijskim hepatitisom - „ni A niti B” istraživači su izazvane razviti metode sposobnih za otkrivanje onih s HCV i prikladni su za dijagnosticiranje akutne i kronične hepatitisom C. Nađeno je da su HCV antigeni cirkuliraju izuzetno niskim koncentracijama, a jasno je da je metodološki razina kasnih 80-ih godina XX stoljeća, koristi se za otkrivanje virusnih antigena je očito nedovoljno.

    1989, skupina istraživača tvrtke „Chiron Corporation” pod smjeru Q-L.Choo provodi kloniranje HCV RNA i bio Imunoreaktivni oligopeptidi koji reagiraju s antitijelima koji cirkulira u krvi bolesnika s kroničnim hepatitisom „ni niti B”. Ovi oligopeptidi postali su temelj dijagnostičkih lijekova za otkrivanje protutijela na HCV. Ovo je odredilo brz napredak u razvoju i proizvodnji dijagnostičkih proizvoda. Glavna metoda koja se koristi za otkrivanje anti-HCV je enzim vezan imuno test kao metoda koja zadovoljava zahtjeve praktičnog zdravstvenog -te Visoka osjetljivost, specifičnost i jednostavnost ponašanja.

    S obzirom da je HCV dalje postoji u krvi bolesnika s akutnim i kroničnim hepatitisom C u kombinaciji s anti-HCV dijagnostički proizvodi usmjeriti razvojnim koncentrirane na stvaranje ispitnih sistema za detekciju antitijela, pruža najveću moguću identifikaciju nositelja virusa, i što ranije dijagnosticiranje akutne infekcije. Raznolikost antigena i antigenske determinante koje kodiraju strukturne i ne-strukturnog područja HCV RNA, određen smjer u dizajnu dijagnostičkih pripravaka za ove konstrukcije i oligopeptidi koji se koriste za izradu njih. Tijekom vremena proteklo od otkrića HCV, dijagnostičkog sustava tri generacije (Tablica 1).

    Tablica 1
    Dijagnostički lijekovi za otkrivanje anti-HCV [9]

    Primijenjeni peptidi,
    zona HCV RNA u kojoj
    oni su kodirani

    % detekcije nosača
    HCV

    Vrijeme prvog
    otkrivanje
    anti - HCV iz
    rana jaundica

    5-1-1 NS3
    C100-3 NS4

    C22-3 jezgra
    C200 NS3 i NS4
    NS3p NS3
    C 100-3 NS4

    C22-3 jezgra
    C200 NS3 i NS4
    NS3p NS3
    Peptid NS5

    Uvođenje dodatnih peptida, prije svega c22-3 (Core), u dijagnostičke lijekove druge i treće generacije, omogućilo je rješavanje glavnog zadatka, odnosno povećanja osjetljivosti, specifičnosti i, najvažnije, detekcije anti-HCV. Zahvaljujući dijagnostičkim krivuljama treće generacije, moguće je detektirati do 97% HCV nosača. Istovremeno, određena rasprava potaknuta je uvođenjem peptida koji je kodiran NS5 HCV RNA regijom u dijagnostiku. Prema nekim istraživačima, prisutnost ovog peptida nije od temeljne važnosti za poboljšanje kvalitete dijagnostičkog lijeka. [10,11]. Međutim, protutijela NS5 mogu se otkriti u ranijem vremenu infekcije, što poboljšava kvalitetu laboratorijske dijagnoze akutnog hepatitisa C. [12]

    Trenutačno se dijagnostički pripravci treće generacije koriste diljem svijeta, uključujući i Rusiju. Peptidi koji se koriste u dijagnostičke pripravaka dobivenih rekombinantne tehnologije (npr dijagnostičke tvrtki: „Dijagnostički sredstva”, Nizhny Novgorod, „vektor”, Novosibirsk, „Roche”, „Abbott” et al.), Ili sintetički ( 000 MC "Avicenna", Sankt Peterburg, "Organon", itd.). Dijagnostika, u kojoj su istodobno korištene obje vrste peptida, primljene su oznake kao pripreme 4. generacije. Po njihovim svojstvima, ti lijekovi nemaju značajne razlike. Usporedni testovi, koje redovito provodi Ministarstvo zdravstva Rusije, pokazali su usporedivu osjetljivost dijagnostičkih preparata domaćih i stranih proizvođača.

    Utvrđeno je da se upotreba dijagnostičkih lijekova treće generacije za otkrivanje anti-HCV među imunokompetentnim populacijama (na primjer, donatore krvi) procjenjuje na 98,8-100%. Istovremeno, među imunokompromitiranim pojedincima, na primjer, kao što su bolesnici nakon transplantacije bubrega, koštane srži ili osobe zaražene HIV-om, ova je brojka znatno niža - 50 do 95% [12]. S.George i sur. [13] pokazala je da 8,4% bolesnika s HIV infekcijom ima lažno negativne rezultate otkrivanja anti-HCV. U takvim pacijentima tijekom promatranja može se zabilježiti učinak sero-reverzije; registracija pozitivnog rezultata nakon seronegativnog anti-HCV razdoblja [14].

    Jedan od najvažnijih problema u provođenju studija za prisutnost anti-HCV je lažno pozitivan rezultat. Njihov izgled može biti posljedica nespecifične interakcije reakcijskih komponenti, mogućih križnih reakcija s drugim virusnim antigenom i mnogim drugim čimbenicima. Razina lažno pozitivnih rezultata u otkrivanju anti-HCV s različitim dijagnostičkim lijekovima može doseći 10-20% [15,16]. Povećana razina takvih rezultata zabilježena je kod bolesnika s onkološkim i autoimunim bolestima, osoba s imunodeficijentnim stanjima i bolesnika sifilisa [16,17]. Postojanje lažnih pozitivnih rezultata rezultira zadatkom laboratorijskog radnika da ih razlikuje od prave detekcije anti-HCV-a. Da bi se riješio taj problem, serum se detektira u krvnom serumu HCV RNA. Međutim, negativni rezultat otkrivanja HCV RNA ne dopušta govoriti o prisutnosti lažne pozitivne detekcije anti-HCV. Treba imati na umu da anti-HCV može na izolirani način cirkulirati u krvi pacijenta koji se oporavio od akutnog hepatitisa C (10-15%) ili koji je uklonio HCV RNA kao rezultat tekuće terapije.

    POTVRDA (DODATAK) ISPITIVANJA. Za razlikovanje lažno pozitivnih uzoraka i uzoraka koji stvarno sadrže protutijela na HCV, razvijeni su dodatni (Dopunski) testovi. Najčešće u tim testovima koristi se princip imunoblota (na primjer, RIBA test ("Ortho-Clinical Diagnostics"); „LiaTek HCV” (Organon Teknika)], kada se adsorbira na nitroceluloznu membranu u obliku pojedinačnih traka antigena kodiran različitim zonama HCV RNA. Anti-HCV reagira s adsorbiranim antigenima s antitijelima obilježenim enzimima protiv ljudskog IgG, nakon čega slijedi detekcija s kompleksom supstrata. Dodatno imunoblot kao dodatna ispitivanja koriste dijagnostičkih sredstava za otkrivanje anti-HCV protiv antigena kodiranih od različitim zonama HCV RNA [ „spektar 4” ( „ImBio” Nižnji Novgorod, RecombiBest anti-HCV spektra „- ZAO” Vector Best ", Novosibirsk, IFA-Anti-NSO-Spectrum, NVO" Dijagnostički sustavi ", Nizhny Novgorod].

    Dizajn i primjena tih ispitivanja je paralelna s uvođenjem screening ispitivanja za anti-HCV, ponavljajući princip širi spektar peptida koji se koriste u svakom uzastopnom generaciju dijagnostičkih sredstava. Dakle, dijagnostički RIBA-III se razlikuje od prethodne generacije dodavanjem peptida koji je kodiran NS5 zonom. Načela da se potvrdi pozitivan rezultat detekcije anti-HCV ponajprije su: mogućnost (u nekim slučajevima), preciznije rezultate enzimske reakcije reakcijom s pojedinim peptidima, kao i upotrebu u širenju spektra DIAGNOSTICUM peptidi koji se ne koriste u 'screening' analizama. Samo uvođenje novih peptida omogućuje povećanje dijagnostičke vrijednosti potvrdnih testova.

    Tumačenje rezultata dobivenih, na primjer, u takvom testu kao i RIBA-III, uključuje tri moguća odgovora: pozitivan, negativan i neodređen rezultat. Potonji se izdaje u nedostatku jasnih indikacija (prema uputama priloženim dijagnostičkom kompletu), što omogućuje da se definitivno ocjenjuje prisutnost ili odsutnost anti-HCV u uzorku ispitivanja. Korelacija spektra snimljenih odgovora tijekom potvrđenih testova varira ovisno o karakteristikama skupina pacijenata kod kojih se primarno detektira anti-HCV [18]. Prema J.M. Pawlotsky i sur. [19], u polovici slučajeva rezultata, interpretiranih kao "nejasni", može se otkriti HCV RNA. Prema našem mišljenju, valjanost odgovora - "nejasan rezultat detekcije anti-HCV" koji laboratorijski radnik daje kliničaru, vidljiv je ne samo u provođenju potvrđivanja, već iu rutinskim istraživanjima o prisutnosti anti-HCV. Nužno je takvo tumačenje dobivenih rezultata odraz trenutnog stanja laboratorijske dijagnoze hepatitisa C.

    ODREĐIVANJE IgM ANTI-HCV. Trenutno su stvorene i proizvedene dijagnostičke komplete za otkrivanje IgM anti-HCV od strane tvrtki: "Vector Best"; "Dijagnostički sustavi"; "Imbio", "Abbott", itd. U fazi projektiranja dijagnostičkih kompleta razvijeni su ELISA kompleti, zasnovani na peptidima kodiranim različitim područjima HCV RNA [20]. Izbor je zaustavljen na peptidu koju kodira jezgra regije HCV RNA i otkrivanje IgM protutijela na njega. Kao i kod testova za otkrivanje anti-HCV (IgG), lažno pozitivne rezultate mogu se zabilježiti u istraživanju IgM anti-HCV. Prema Stevensona D.L. s et al. [21], do 70% bolesnika s kroničnim hepatitisom C s prisutnošću IgM anti-HCV istodobno je imalo povišenu razinu reumatoidnog faktora, što pridonosi pojavljivanju lažnih pozitivnih rezultata. Istodobno, prema Pawlotsky J.M., prisutnost reumatoidnog faktora ne utječe na kvalitetu detekcije IgM anti-HCV [22].

    ODREĐIVANJE ANTIGENA HCV. Mogućnost određivanja HCV antigena privukla je pažnju istraživača odmah nakon otkrića virusa. Teorijski mogućnost ispitivanja njih je pokazano Krawczynski K. et al [23] su otkrili da imunohistokemije u tkivu jetre HCV antigena, pokazuje specifičnost imunofluorescencije sjaj. Upotreba poli- i monoklonskih protutijela s različitim antigenima HCV uspostavila prisutnost HCV jezgre Ag, antigena kodiranih NS3 i NS4 područja HCV RNA u jezgri i u citoplazmi hepatocita, u 60-90% bolesnika s kroničnom HS [24].Meðutim daljnja ispitivanja su pokazala da je antigeni HCV mogu se otkriti u manje od 5% stanica jetre.

    Prvi dijagnostički test sustava ( „Orto antitijela na antigen jezgre (mišje monoklonsko) EL1SA Test sustava” i „Imucheck F-HCV Ag jezgre Kokusai”) za otkrivanje HCV antigena pojavio na tržištu imunoloških proizvoda u 1999. godini. U svrhu detekcije, izabran je Core HCV antigen, koji se određuje pomoću ELISA varijante krute faze dizajnirane na osnovi monoklonskih protutijela. Prve studije o primjeni tih testova su identificirali svoju visoku osjetljivost, specifičnost, i obećavajuće aplikacija, prvenstveno u službi transfuzije krvi [25,26]. osnovana:

  • mogućnost određivanja jezgre Ag HCV u serumu ili plazmi;
  • specifičnost detekcije Core Ag HCV;
  • prisutnost osoba s cirkulirajućim antigenom u krvi seronegativno za anti-HCV;
  • čest (90,3%) jezgre HCV Ag detekcija u serumu uz prisutnost anti-HCV i HCV RNA [25];
  • izravna korelacija između koncentracije HCV RNA i detekcije Core Ag HCV [25];
  • smanjujući fazu "prozora" - od trenutka infekcije do prvog pozitivnog rezultata otkrivanja anti-HCV. Utvrđeno je da se HCV Core Ag može otkriti u 83% slučajeva (n = 24) dan nakon prve detekcije HCV RNA [26] i dugog (u prosjeku 26 dana) prije pojave anti-HCV [27].

    Postupci otkrivanja RNA HCV. Suvremena faza laboratorijske dijagnostike hepatitisa C može se karakterizirati kao stupanj početka široke primjene molekularnih bioloških metoda za otkrivanje HCV RNA. Prekomjerna većina metoda za otkrivanje nukleinskih kiselina ispitana je za otkrivanje HCV RNA. Načela izrade dijagnostičkih pripravaka i njihova upotreba za otkrivanje virusne DNK ili RNK posvećeni su značajan broj pregleda literature objavljenih u domaćim [28] i stranim publikacijama [29]. Sve ove metode se mogu podijeliti u dvije skupine, koje se temelje na primjeni načela hibridizacije bez amplifikacije odabrane regije nukleinske kiseline ili njihovom amplifikacijom, što značajno povećava snagu razdvajanja metode.

    Metoda hibridizacije na temelju kombinacije obilježenih hibridizacijskih sondi (genetski modificirane ili sintetske molekulske strukture koje sadrže nukleotidne sekvence komplementarne na odabrane RNA mjesta). Rezultati se uzimaju u obzir intenzitetom signala koji dolazi iz oznake u sastavu formiranog kompleksa.

    U hepatitisu C, ova metoda detekcije HCV RNA primarno je pronašla aplikaciju za njegovu identifikaciju izravno u hepatocitima, u testovima označenim kao in situ hibidizacija [30]. Mogućnost izravnog otkrivanja HCV RNA u tkivima omogućila je njegovo otkrivanje u mononuklearnim krvnim stanicama, stanicama žlijezda slinovnica i ostalim tkivima bolesnika s hepatitisom C [31, 32].

    Hibridizacijska metoda koja se koristi za otkrivanje HCV RNA omogućuje da se pokaže prisutnost negativnih (replikacijskih) lanaca HCV RNA, što ukazuje na aktivnu replikaciju virusa [33].

    Metoda lančane reakcije polimeraze - trenutno najčešće korištena metodička metoda, koja je temelj gotovo svih molekularnih bioloških metoda za otkrivanje HCV RNA. Štoviše, određivanje HCV RNA je moguće u kvalitativnim i kvantitativnim verzijama, što je osobito važno za imenovanje, praćenje i procjenu učinkovitosti korištene terapije.

    Glavne varijante metode mogu se identificirati na sljedeći način:

  • lančana reakcija polimeraze (PCR);
  • ligaza lančana reakcija;
  • NASBA;
  • TMA (transkripcijski amplificirana amplifikacijska reakcija, Transkripcija-posredovana amplifikacija).

    Lančana reakcija polimeraze - naširoko koristi i u Rusiji i inozemstvu metodu otkrivanja HCV RNA. Temelji se na procesu s više ciklusa, koji podsjeća na prirodnu replikaciju nukleinske kiseline, svaki ciklus koji se sastoji od uzastopnih stadija.

    Iz ispitivanog materijala (seruma ili plazme krvi, biopsije jetre), HCV RNA se oslobađa. S obzirom da je nukleinska kiselina HCV predstavljena s RNA, a za amplifikaciju, molekula cDNA je potrebna enzim-reverznom transkriptazom, nastaju jednolančane molekule HCV cDNA. U sljedećem koraku, takozvana "cDNA" se dodaje u određeni dio svakog od lanaca HCV cDNA. Primeri - kratki oligonukleotidi, komplementarni poznatim nukleotidnim sekvencama. Usporedba primarne strukture 5'UTR regije genoma različitih izolata HCV otkrila je njihovu neznatnu varijabilnost (između genotipova, homologija nukleotida - 92-98% i unutar genotipa 98-99%). To je pogodilo odabir primera iz ove zone HCV RNA i njihovu upotrebu u dijagnostičkim testnim sustavima proizvedenim u našoj zemlji i inozemstvu.

    Nadalje, uz pomoć enzima DNA polimeraze ovisne o DNA, sintetizirani su novi odsječci DNA. Trenutno je izvor ovog enzima je najčešće korišteni thermophilus termus bakterije (Tth-polimeraza) ili thermophilus aquaticus (Taq-polimeraza). Toplinskom stabilnošću u prisutnosti mangana i magnezijevih iona, enzim se može istovremeno koristiti za sintezu komplementarnih jednolančanih molekula HCV cDNA i amplifikaciju cDNA odabranih porcije. U završnoj fazi jednog reakcijskog ciklusa, sinteza DNA sintetizira nove lance komplementarnih HCV cDNA. Više ponavljanja iz reakcijskog ciklusa dovodi do nakupljanja HCV cDNA fragmenta, koji može biti registriran pomoću polikarilamidne gel elektroforeze, nakon čega slijedi vizualno detekciju, ili pomoću hibridizacije s oligonukleotidne sonde, što povećava osjetljivost i specifičnost dijagnostičkih proizvoda koji se koriste. Upotreba primera obilježenih enzimima omogućava snimanje rezultata PCR pomoću enzimskog imunotestiranja.

    Konstantan cilj istraživača koji oblikuju dijagnostičke sustave za otkrivanje HCV RNA je povećanje osjetljivosti i specifičnosti. Ova svrha služi PCR varijantom, nazvanim "ugniježđena PCR" [34]. Značajka ove metode iz "klasične" je istodobna upotreba dvaju parova primera, od kojih je jedan komplementarno povezan s unutarnjom regijom amplikona dobivenog nakon prvog kruga amplifikacije. Istodobno, vjeruje se da ova varijanta PCR-a ima veći rizik kontaminacije uzoraka, što može dovesti do lažnih pozitivnih rezultata [35].

    Akutna potreba da se HCV RNA i poteškoće povezane s proizvodnjom velikih razmjera vrlo osjetljivih i specifičnih dijagnostičkih kitova za dijagnostičke PCR identificirati široko korištenje proizvoda proizvedenih u laboratorijima. Usporedba tih ispitnih sustava, tzv - „dom” test ( „u kući testova”), je pokazao svoju veliku varijabilnost u osjetljivosti i specifičnosti, kao i nedostatak ponovljivosti rezultata između laboratorija i dijagnostički pripravci serije. Tako, apsolutno mogu točno utvrditi prisutnost ili odsutnost virusne RNA u kontrolnim uzorcima pruža u toku prvog ciklusa Europskog procjene kontrole „vanjski” kvalitete HCV RNA (1996) 136 laboratorija samo 22 (16%) [36]. Sličan rezultat zabilježen je u našoj zemlji, u istom operacije u okviru Savezne kontrole kvalitete vanjskog (2001), kada su 14 sudionice laboratoriji samo 3 (21,4%) bili u mogućnosti pravilno riješiti problem. [37]

    Uzroci lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata otkrivanja HCV RNA su različiti. S lažno negativnim rezultatima:
    - gubitak ili uništavanje HCV RNA u pripremi za odgovor kliničkog materijala;
    - prisutnost u uzorku inhibitora koji utječu na različite komponente PCR-a. Ovi inhibitori predstavljaju različite kemijske ili proteinske tvari. Na primjer: prisutnost inhibitora reverzne transkriptaze u tekućini sperme nije dopustila otkrivanje HCV RNA i razgovor o mogućnosti provođenja seksualnog puta prijenosa hepatitis C [38]; prisutnost hepaprine [39]; visoka razina krioglobulina u krvnom serumu [40];
    - nepoštivanje toplinskog režima skladištenja i transporta kliničkog materijala. S lažnim pozitivnim rezultatima:
    - kontaminacija između uzoraka (pri obradi uzoraka i / ili radnji s reakcijskom smjesom), uključujući onečišćenje s pozitivnim kontrolnim uzorkom;
    - kontaminacija po proizvodima prije pojačavanja (amplicons) koji mogu zagaditi ispitne uzorke i otopine pomoću aerosola ili laboratorijske opreme.

    Masovno uvođenje PCR dijagnostike definiranjem RNK HCV-a stavilo je tijela praktične zdravstvene skrbi zadatak prelaska na novu razinu provođenja laboratorijskih studija. Izolacija izoliranih zona za glavne faze PCR-a (za pripremu uzoraka, pojačanje, uzimanje u obzir rezultata); Odvojeni kit za svaku fazu reakcije laboratorijske odjeće, automatskih pipeta; postojanje standardnih dijagnostičkih kompleta i, što je najvažnije, dostupnost visoko kvalificiranog laboratorijskog osoblja omogućuje smanjenje razine lažnih rezultata.

    Prvi standardizirani komplet za određivanje HCV RNA ("Amplicor ™ HCV", "Roche Diagnostic Systems") proizveden je 1993. godine. Tijekom godina razvijene su setove za otkrivanje HCV RNA, čija je glavna svrha povećati njihovu osjetljivost i specifičnost. Pri projektiranju „Amplicor TM HCV” koristi se nekoliko originalnih metodoloških tehnika koje omogućuju otkrivanje ili iznad 100 kopija HCV RNA po ml., Kao i da se bave mogućim slučajevima kontaminacije uzoraka i otopina koje se koriste u setu. Pomoću enzima - amperazy i deziksiuridintrifosfata (dUTP) omogućuje da se uništi u prvom ciklusa pojačanja od prethodnih aplikony koje mogu pojaviti onečišćenja. Razaranje amperaze na kraju prvog ciklusa pojačanja (pri + 55 ° C) ne dozvoljava enzimu da uništi amplikone odabrane kao ciljeve. Važna inovacija bila je uvođenje interne kontrole. Značenje ove inovacije sastoji se u uvođenju uzorka u svakoj sekvenci takvo umnožene HCV RNA dijela koji je zatim detektiran pomoću odgovarajućih klica u reakciji amplifikacije na isti način. Odsutnost pozitivne reakcije u otkrivanju interne kontrole ukazuje na lažno negativnu reakciju na prisutnost HCV RNA u uzorku. Dijagnostika sljedeće generacije bio je lijek označen kao "HCV Amplicor 2.0", koristeći graničnu osjetljivost 50 molekula HCV RNA.

    Sustav za otkrivanje HCV RNA korištenjem Rocheovih kompleta ne može se uzeti u obzir izolirano od njihove instrumentacije, što određuje visoku kvalitetu ispitivanja. Programeri metode nastojali su potpuno automatizirati sve faze reakcije. Sadrzaj ove ideje je sustav „COBASAmpliPrepTM”, što omogućuje da se u potpunosti automatizirati proces ekstrakcije HCV RNA, amplifikacije i detekcije, čime se smanjuje rizik od lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata, uz zadržavanje visoke osjetljivosti i specifičnosti [41].

    Lančana reakcija lanca laziranja detekcije RNA BGC (LCR). Metoda se temelji na sposobnosti enzima "DNK DNA koja ovisi o DNA" da umrežava (ligira) prekida fosfodiesterske veze u DNK u prisutnosti ATP i Mg 2+ iona. Kao i kod "klasičnog" PCR-a za otkrivanje HCV RNA, prva faza LCR-a je reverzna transkripcija kako bi se dobila HCV cDNA. Nadalje, DNK ligaza veže dva para primera (komplementarna na 5 'nekodiranu HCV RNA regiju), koja se dalje pojačavaju. Detekcija produkata amplifikacije LCR provodi se uzimanjem u obzir reakcije antigena i antitijela. Svaki od dva primera označen je različitim haptenom. Prvi od njih zarobljen je antitijelima adsorbiranim na mikročesticama. Nakon postupka pranja, koristeći drugi par antitijela obilježenih fluorescentnom oznakom, selektivno reagiraju s haptenom u proizvodu za amplifikaciju, nakon čega slijedi reakcija supstrata i uzimajući u obzir fluorometar.

    Osjetljivost ove metode iznosi oko 200 primjeraka HCV RNA u ml, što omogućuje da se koristi za rješavanje različitih kliničkih i dijagnostičkih problema [42]. Trenutno, dijagnostički setovi za otkrivanje HCV RNA, temeljeni na LCR-u, proizvodi Abbott.

    Nucleic Acids pojačanje Seaquencence - NASBA -metoda detekcije HCV RNA temelji se na istovremenom djelovanju tri enzima: reverznom transkriptacijom virusa ptičje mijeloblastoma, RNAsease H i RNA polimeraze T7 [43]. Za razliku od RT PCR, reverzna transkripcija HCV RNA se ne provodi u prvoj fazi. Uz pomoć korištenih enzima, u roku od 90 minuta može se dobiti više od 10 (9) kopija HCV cDNA mjesta [44]. Sposobnost provođenja reakcije pri niskim temperaturama (+41 ° C) uvelike pojednostavljuje rad i omogućava napuštanje opreme koja pruža cikličke promjene u visokim temperaturama. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir elektrokemijalnom ekscizijom. Unatoč činjenici da je osjetljivost NASBA blizu RT PCR, metoda nije široko korištena za otkrivanje HCV RNA. Trenutno se razvija varijanta metode koja kombinira principe NASBA i "Real-time RT PCR".

    Metoda transkripcije posredovane amplifikacije (TMA) razlikuje se od PCR i LCR prvenstveno po tome što su HCV RNA fragmenti direktno amplificirani, umjesto HCV cDNA. U početnoj fazi reakcije, klica (br. 1) je vezana na HCV RNA i kopija ciljne molekule, cDNA, je sintetizirana uz pomoć enzima (reverzna transkriptaza). Reverzna transkriptaza, koja također ima aktivnost RNaze-H, uništava virusnu RNA u RNA-cDNA hibridu. Zatim je pričvršćen drugi premaz na cDNA molekulu, nakon čega slijedi završetak dvolančane DNA reverznom transkriptazom. Pomoću drugog enzima dolazi do RNA polimeraze, RNA transkripcije s cDNA koja rezultira formiranjem 100 do 1000 kopija ampikona HCV RNA u jednom reakcijskom ciklusu. Primer br. 2 je vezan za ove RNA aplicone s daljnjom sintezom cDNA kopija i uništavanjem RNA molekule. Dodatak primera br. 1 u cDNA nakon čega slijedi završetak dvolančane DNA aktivira sljedeći ciklus amplifikacije. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir na lumenometru, budući da nastali RNA amplikoni specifično djeluju u interakciji s DNA sondama označenim kemiluminfora.

    Kao prednosti TMA metode pri otkrivanju HCV RNA, zabilježeno je:

  • reakcija pri nižim temperaturama u usporedbi s PCR;
  • formiranje većeg broja amplikona u jednom reakcijskom ciklusu, što smanjuje vrijeme potrebno za dobivanje konačnog rezultata (30-40 minuta) i povećava osjetljivost reakcije (50 kopija / ml) [45].
  • smanjujući rizik kontaminacije, budući da je RNA manje stabilna od DNA.

    Usporedne studije o otkrivanju HCV RNA pomoću TMA i drugih metoda pokazale su visoku razinu podudarnosti rezultata [45].

    Kombinacija načela hibridizacije i amplifikacije temelji se na postupku otkrivanja HCV RNA, označenog kao "Metoda hibridizacije rabeći razgranate sonde ili degradirane DNA test (bDNA) [46]. Za razliku od PCR u ovom testu, pojačanje ne uključuje molekule HCV cDNA, već signal. Reakcija se izvodi na pločama s 96 jažica, u kojima su adsorbirani fragmenti HCV RNA iz 5 „netranslatiranu regiju, a jezgra-gena HCV RNA. Zbog naknadne vezanje sa sintetičkim DNA molekule razgranati i hibridizacije s probom koja je označena s pojačalom alkalne fosfataze i zatim enzimske reakcije postiže oštar porast primljenog signala. Trenutno postoji diagnosticums treću generaciju tržištu dijagnostiku (Bayer 3,0-Hepati TIS C Virus RNA kvantifikacije s Brna) ima osjetljivost prepoznavanja 520 IU / ml (2500 kopija HCV RNA).

    KVANTITATIVNO OTKRIVANJE HCV RNA. Kvantitativna varijanta PCR-a se koristi za procjenu koncentracije HCV RNA. Početku, koncentracija HCV RNA je pokušao karakterizaciju rednih vrijednosti, kao što su „+”, „++” itd vizualno reflektirajuća Intenzitet vrpci dobivenih elektroforeze amplifikacijskih produkata ili ograničavajućim razrjeđenjima, odnosno prisutnošću pozitivnog rezultata u konačnom titracijska točka. Poteškoće u standardiziranju svih faza PCR ne dopuštaju objektivnu procjenu koncentracije HCV RNA, što dovodi do značajnih pogrešaka u interpretaciji dobivenih rezultata.

    Trenutačno, rezultati istraživanja su izraženi u kvantitativnim jedinicama: broj kopija HCV RNA sadržan u 1 ml., U apsolutnim ili logaritamskim uvjetima (log 10). Temelji se na činjenici da je koncentracija HCV RNA ukazuje na broj virusnih čestica, taj podatak se naziva „virusa ekvivalent (ekv)”, uz dodatak prefiksa k (kg) ili tisuća M (ppm). Drugi način za izražavanje broja čestica virusa je njihov ekvivalent težine. Na primjer, u gramima ili pikogramima (1 pg odgovara oko 1 mil. Eq). Raznolikost primijenjenih količina otežava tumačenje rezultata dobivenih u različitim laboratorijima. Stoga, WHO Expert odbor biološkoj standardizaciju učinila „međunarodni referentni materijal” sadrži HCV RNA (liofilnovysushennaya krvni serum koji sadrži HCV RNA je genotipove 1), što je koncentracija koja je izražena u internacionalnih jedinica (IU / mL) [47]. Posebni faktori omogućuju nam da preračunate dobivene vrijednosti koncentracije u međunarodne jedinice.

    Gotovo sve varijante PCR koriste se za određivanje koncentracije HCV RNA. Istovremeno, dijagnostičkim lijekovima prikazani su brojni specifični zahtjevi, od kojih je najvažnije stroga linearnost rezultata, tj. povećanje signala detektirane reakcije s povećanjem koncentracije HCV RNA u uzorku ispitivanja. Korištenje internih standarda s različitim sadržajem HCV RNA izbjegava mnoge metodološke pogreške koje mogu utjecati na konačni rezultat reakcije [28]. Osjetljivost primjenjuje dijagnostiku (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCX HCV RNA test kvantitativno) može otkriti HCV RNA s početkom na 50 kopija po ml [48.49], što je posebno važno za predviđanje učinkovitosti antivirusne terapije izabrao.

    PCR u stvarnom vremenu ("real-time RT PCR") -jedna od najpoželjnijih mogućnosti za kvantitativnu metodu za otkrivanje HCV RNA. Metodu i njegov hardver zajednički su razvili stručnjaci tvrtke Roche i Percin Elmer. Princip metode je sposobnost hidrolize cDNA sekvenci u smjeru 5 '---- 3'. U reakciji se koristi posebna sonda, označena s dvije fluorescentne boje s bliskom apsorpcijom i fluorescentnim maksimumima. U prisutnosti produkata amplifikacije, Tag-polimeraza cijepa sondu koja sprječava prijenos energije iz jedne molekule boje na drugu i time sprječava oslobađanje kvantne svjetlosti. Poseban uređaj uzima u obzir reakciju i matematičko modeliranje fluorescentne kinetike u svakoj fazi reakcije, što omogućuje dobivanje informacija o početnoj koncentraciji HCV RNA.

    Razlikovno značajka „PCR u realnom vremenu” smatra moguće dobiti informacije o prisutnosti HCV RNA neposredno tijekom reakcije, čime se smanjuje vrijeme ispitivanja koji u kombinaciji s visokom osjetljivošću i linearnosti rezultata [50]. Prema Tatiana Yashini i koautorima, ova metoda omogućuje detektiranje od 200 kopija HCV RNA u ml. [51].

    Postupci genotipizacije RNA VHC. Određivanje povezanosti HCV-a s određenim genotipom i podtipom utvrdilo je njegovu primjenu za rješavanje ne samo čisto znanstvenih, već i praktičnih problema. Na primjer: traženje izvora infekcije tijekom epidemije hepatitisa C ili predviđanje učinkovitosti korištene terapije.

    „Zlatni standard” genotipa HCV - izravno određivanje primarne strukture HCV RNA i njegovoj filogenetski analizu [52], koji omogućuje jasno karakterizirati izolata virusa. Te informacije možete dobiti pomoću sljedećih opcija slaganja:

  • izravno;
  • zasnovano na standardnom kloniranju;
  • sekvencioniranje produkata PCR reakcije (ograničeno sekvenciranje).
    Usprkos točnosti rezultata, metoda izravnog redoslijeda ne koristi se u praktičnoj zdravstvenoj zaštiti zbog tehničkih poteškoća u provođenju istraživanja i visokim troškovima rada. Istovremeno, dostupnost informacija o primarnoj strukturi HCV RNA je referentna metoda genotipizacije, a dostupnost automatskih uređaja za sekvenciranje pojednostavljuje rezultate.

    Trenutno, u većini slučajeva, metode temeljene na korištenju PCR-a s tip-specifičnim primerima koriste se za genotipiranje HCV RNA. Prvo genotipiranje HCV RNA provedeno je u N. Okamoto et al. 1992. godine s RT-PCR [53], što uključuje dva koraka amplifikacije. Prva od njih je provedena s univerzalnim primerima za sve genotipove HCV-a, a druga s mješavinom tip-specifičnih primera kako bi se dobili specifični produkti amplifikacije različitih duljina. Prisutnost određenog genotipa prosuđena je veličinom amplificiranog produkta. Kao početnice koriste se specifične sonde, informacije o kojima se nalazi u 5'UTR, Core ili NS5 područjima RNKVS [54].

    Hibridizacija pojačanih produkata s genski specifične sondi adsorbiranih (s 5 „netranslatirane regije HCV RNA), adsorbirani na nitroceluloznu membranu, nalazi se na osnovi ispitivanja - označeno‘INNO-Lipa HCV, Inno-genetikom’[55]. U početku je uz pomoć ovog testa moguće tipizirati genotipove: la; lb; 2a; 2b; 3a; 3; 4 i 5a. U budućim testnim sustavima druge generacije "INNO-LiPA HCV II, INNOGENETIKA" dopušta se i razlikovanje svih 6 genotipova i 2c; 2d; 2i; 3c; 4a-h; 6a i 10a. [56]

    Metodološki arsenal HCV genotipizacije nije ograničen na gore navedene postupke i obuhvaća različite metode:

  • genotipizacija na temelju analize restrikcijskih profila amplificiranih produkata (RFLP). Produktovi amplifikacije HCV RNA fragmenata (5'UTR-regije ili NS5 HCV RNA regije) digestiraju se restrikcijskim enzimima. Formirani fragmenti razlikuju se po dužini, ovisno o restrikcijskim mjestima unutar kojih se cijepaju. Rezultati elektroforeze i njihova usporedba omogućuju identificiranje HCV genotipa u ispitnom uzorku [57]. Usporedba rezultata genotipizacije primjenom PCR-RFLP metode sa sekvenciranim podacima pokazala je visoku razinu podudarnosti rezultata - 95% [58].
  • genotipizacija na temelju SSCP metode (procjena konformacijskog polimorfizma pojedinačnih DNA fragmenata). Kao predmet studije odabrano je 5'-netranslatirano područje HCV RNA, koja ima minimalni niz nukleotidnih varijacija koje razlikuju genotipove jedna od druge. Ova činjenica određuje mogućnost primjene zajedničkih primera za genotipizaciju [59].

    SEROTYPING Anti-HCV Istraživanje je moguće zahvaljujući P.Simmonds i sur, utvrditi prisutnost protutijela usmjerenih na epitope koji genotipspetsifichnym informacija kodiranih HCV RNA NS4 zona [60]. S ELISA za diagnosticum konstruiran na bazi sintetskih peptida, koji može razlikovati slučajeva hepatitisa C, koje su uzrokovane virusima 1, 2 i 3 genotip (89% podudaranja s rezultatima genotipizaciju). Razvoj testsistem koristeći sintetske i rekombinantnih antigena kodiranih od NS4 i središnje zone HCV RNA virus poboljšane tipizirani varijante popis i sudac prisutnost podvrsta (1a, lb, 2a, 2b, preko i 4a) [61,62]. Trenutno oslobađanje komercijalni dijagnostičkih pripravaka za serotipizacije u izvedbi licu ELISA - „NA Mureh 1-6 Pokus Serotipiziranje, Murex Diagnostics”, a u varijanti „immunoblot” - RIBA HCV ispitivanje serotipiziranje, Chiron Diagnostics. Usporedni podaci serotipizacije i genotipizacije HCV RNA pokazali su visoku razinu koincidencije rezultata, te su dosegnuli 95% [62].

    Serotipizacija anti-HCV u usporedbi s genotipiziranjem HCV RNA ima prednosti kao jednostavnost reakcije i niže troškove. Istovremeno, ova metoda ni u kom slučaju ne može zamijeniti genotipizaciju. Rezultati serotipizacije anti-HCV-a svjedoče o vrsti anti-HCV u tekućoj ili prethodno prenesenoj infekciji. U nekim slučajevima (najčešće hemofiličare) zabilježen istovremenu detekciju različitih anti-HCV podtipova koje mogu biti indikativni za infekciju množine različitih genotipova HCV i podtipova [63]. Osim toga, kod bolesnika s hepatitisom C u pozadini izrečene RNA imuniteta može biti jedini marker, što ga čini nemoguće provesti serotipizacije.

    OTKRIVANJE I TRAKCIJA REZULTATA ISPITIVANJA SEROLOŠKIH MARKERAČA HCV-INFEKCIJE. Širok raspon seroloških biljega tekuće ili prethodne HCV infekcije, kao i moderne metodološkog okvira može riješiti mnoge probleme u laboratorijskoj dijagnostici i prevenciji hepatitisa C. Tablica 2 prikazuje broj serološke markere HCV infekcije i najvažnija područja njihovog ispitivanja.

    Tablica 2
    Dijagnostička značajnost markera tekuće ili prethodne HCV infekcije

    probir
    u službi
    krv

    potvrđen
    IZJAVE
    rezultat
    + anti-HCV

    Jedan od glavnih zadaća laboratorijske dijagnoze hepatitisa C je dijagnoza i odvajanje akutnih od kroničnog hepatitisa C identificiranjem seroloških markera infekcije. Kao i kod drugih akutnih virusnih hepatitisa, serološki biljezi HCV infekcije dosljedno pojavljuju i nestaju tijekom tijeka infekcije i proces oporavka (Slika 2).

    HCV RNA se može detektirati 7 - 21 dana nakon infekcije s HCV i anti-HCV 20 - 150 minuta na dan (u prosjeku 50 minuta na dan) [64]. Spektar anti-HCV može se razlikovati ovisno o razdoblju akutnog hepatitisa. Vjeruje se da prvi otkriva protutijela koja su kodira Core i NS5 od HCV RNA regije. Anti-HCV na proteine ​​kodirane NS4 zonom nije prisutan u akutnoj fazi hepatitisa C [65]. Usporedna studija razine koncentracije anti-HCV, spektar anti-HCV i HCV RNA u bolesnika s akutnim i kroničnim hepatitisom pokazuju neke razlike [66]. Po našem mišljenju, te se razlike mogu povezati s individualnim karakteristikama infektivnog procesa, što smanjuje njihovu dijagnostičku vrijednost.

    Sl. 2. akutni hepatitis C

    Analogno laboratoriju dijagnozom hepatitisa A i B se očekuje na antitijela za HCV IgM klasa će biti velik kao dijagnostičke vrijednosti IgM anti-HAV i IgM anti-HBc. Međutim, ovi ispitivanje serum pacijenata s akutnim i kroničnim hepatitisom C, u prisutnosti IgM anti-HCV ukazuje na njihovu identifikaciju česte među tim pacijentima - 50-93% i 50-70%, odnosno [67,68], ti rezultati pokazuju da se otkrivanje IgM anti -HCV se ne može koristiti kao marker akutne HCV infekcije.

    Odsutnost marker koji tvrdi da je "zlatni" standard akutnog hepatitisa C određuje potrebu za sveobuhvatnom procjenom dobivenih rezultata na temelju dinamičkog promatranja pacijenta.

    Jednako važno područje primjene visoko osjetljivih metoda za testiranje HCV RNA - smanjenje rizika od posttransfuzije hepatitis C. Potreba za takvim radovima određena je prisutnošću faze "prozora", tj. vrijeme između prvog detekciju HCV RNA i pojavom anti-HCV, kao i postojanje davatelja krvi (pacijente s kroničnim hepatitisom C) koji imaju HCV RNA u odsutnosti anti-HCV. Sadašnji sustav praćenja donacija krvi za HCV uključuje samo testiranje anti-HCV-a, rizik od ugovaranja hepatitisa C i dalje postoji. Polazeći od toga, legitimno je postaviti pitanje testiranja krvi za prisutnost HCV RNA suvremenim metodama (NAT metode su "test amplifikacije nukleinskih kiselina"). Čimbenik ograničavanja ovog rada je visoka cijena istraživanja. Kako bi smanjili troškove, najbolje je testiranje sera bazena (od 8 do 96 uzoraka), zatim pretresa pozitivnog uzorka u slučaju otkrivanja HCV RNA u serumu bazenu. Uzimajući u obzir čimbenik razrjeđivanja željene HCV RNA kada su krvni serumi napuhani, pitanje korištenja najosjetljivijih metoda detekcije postaje od glavne važnosti. Vjeruje se da upotreba dijagnostičkih kompleta za NAT - s osjetljivošću od 50-100 IU / mL može značajno smanjiti rizik od posttransfuzijskog hepatitisa C.

    Bez sumnje, popis problema koji se mogu riješiti prilikom testiranja cijelog spektra markera HCV infekcije nije ograničen na ta dva područja. Dostupnost suvremenih metoda ispitivanja u kombinaciji s poznavanjem njihovih sposobnosti otvara široke mogućnosti za znanstveno i primijenjeno istraživanje hepatitisa C.

  • Top